Top > 実験プロトコール > オリジナル > 形質転換 > コンピテントセル作成 Electroporation

1. 適用可能な宿主
   

   Escherichia coli	JM109	XL-1 Blue	DH5α
   Agrobacterium tumefaciens	LBA4404	GV????	EHA101

   
   
2. 培地・試薬
   LB

   Bacto-Peptone	10g
   Bacto-Yeast extract	5g
   NaCl	10g
   	1l (pH 7.2)

   YEP

   Bacto-Peptone	10g
   Bacto-Yeast extract	10g
   NaCl	5g
   	1l (pH 7.5)

   10% Glycerol、Autoclaved MQ
   

3. 実験操作
   
   1. 大腸菌のグリセロールストックをLBプレート上に播く
      
   2. 37℃で一晩培養しシングルコロニーを得る
      
   3. 10mlのLBにシングルコロニーを植え、一晩振盪培養する。
      
   4. 2リットルの三角フラスコに作成したLB培地（1L）に、10mlの培養液を加える。
      
   5. 37℃（またはそれ以下）で一晩振盪培養する
      
   6. 培養液の濃度を測定する（OD600=0.5〜1.0がベスト）
      
   7. 培養液を500mlの遠心管に分注し、4℃で15分間、5000rpmで遠心する。
      
   8. 上清を捨て、沈殿をそれぞれ500mlの氷冷した滅菌MQ水に懸濁する。
      
   9. 4℃で15分間、5000rpmで遠心し、上清を捨てる。
      
   10. 沈殿をそれぞれ100mlの氷冷した滅菌MQ水に懸濁する。
       
   11. 4℃で15分間、5000rpmで遠心し、上清を捨てる。
       
   12. 沈殿をそれぞれ20mlの氷冷した10%のグリセロールに懸濁する。
       
   13. 4℃で15分間、5000rpmで遠心し、上清を捨てる。
       
   14. 沈殿をそれぞれ1〜1.5mlの氷冷した10%のグリセロールに懸濁する。
       
   15. 50μlずつエッペンドルフチューブに分注する。
       
   16. 液体窒素内にチューブを投入して凍らせる。
       
   17. -80℃で保存する。
       
   18. エッペンドルフチューブを氷上に立てて、コンピテントセルを溶かす。
       
   19. 5μlまでのDNA溶液を、加えて懸濁する（少な目が良い）。
       
   20. 懸濁液をキュベットに移す。
       
   21. キュベット内の泡を抜く。
       
   22. ジーンパルサーを以下の条件に合わせる
       
       • 2.5KV （または1.8KV）
       • 25μF
         
       • 200 Ω
         
   23. FIRE!
       
   24. キュベット内に、LB（またはSOB、SOC）を1ml加えて懸濁
       
   25. 懸濁液を元のチューブに戻して、37℃で30〜60分振盪する。
       
   26. 適当量（コンピテンシーに依存）を抗生物質入りのLB培地に播く。
       
   27. 37℃で一晩培養する。