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●●●●● Invitrogen Kit (First Trak) ●●●●●
はじめに
ここでは、Fast Track mRNA Isolation Kit ver.3.2 (Invitrogen Corporation) を用いて、mRNAを抽出する方法を紹介します。0.4〜1.0gの組織の試料を用いて行います。この方法で、抽出されたmRNAは、cDNAの合成、Northern blot analysisに用いることができます。筆者らは、この方法を用いて、柱頭1,000個からcDNA ライブラリーを合成しました。現在、Fast Track mRNA Isolation Kit ver.3.5が販売されていますが、手法はver.3.2と基本的に同じです。
RNAを取り扱う実験の場合、実験者は最も危険なRNaseの混入源となってしまうため、汚染を防ぐため、ディスポーザブル手袋をつけて、もし話す必要がある場合はマスクもつけて実験を行います。また、試薬や器具もRNA実験専用とします。
- キット付属の試薬
| 110ml |
Stock Buffer |
| 16ml |
Elution Buffer |
| 2ml |
RNase/Protein Degrader |
| 4ml |
2M NaOAc |
| 10ml |
5M NaCl |
| 6 Tablets |
Disposable Spin Columns and Oligo(dT) Cellulose Tablets |
| 6 each |
Microcentrifuge Tubes |
| 240ml |
Low Salt Wash Buffer |
| 220ml |
Binding Buffer |
- 準備するもの
乳鉢、乳棒、薬匙
※ これらは、あらかじめ121℃で20分間オートクレーブした後、180℃で5時間乾熱滅菌しておく
メスピペット、シャーレ（ディスポーザブルのもの）
- プロトコール
- 1g以下の試料を、エッペンドルフチューブに入れるかあるいはアルミホイルで包み、液体窒素で急速に凍結させる。すぐ用いるときは以下の操作に従い、しばらく用いない場合は -80℃で数か月間保存できる。
- Stock Buffer に沈殿があったら45℃に温めて溶かす。Stock Buffer 15ml にRNase/Protein Degrader 300ul を加えたものを Fast Track Lysis Buffer とする。各試料ごとに、Fast Track Lysis Buffer 15mlを用意する。
- あらかじめ乳鉢と乳棒を液体窒素で冷却しておき、そこで試料を粉末になるまですりつぶす。
☆ この操作は手早く行い、試料が融解しないように適宜液体窒素を注ぎながら行う。
- 50mlコーニングチューブに Fast Track Lysis Buffer 5ml を入れておき、液体窒素で冷却した薬匙で、粉末にした試料をこのコーニングチューブに移してかき混ぜながら溶かす。
☆ Fast Track Lysis Buffer により、組織を溶解する。
- 溶解液をシャーレに移し、18-21ゲージのシリンジで吸い込み、コーニングチューブへ戻す。この操作を4回繰り返す。その後、Fast Track Lysis Buffer の残り (10ml)でシャーレを洗って、その液を同じコーニングチューブに入れる。
☆ この操作によって、高分子のDNAが小さな断片に剪断される。
- コーニングチューブのふたの周りをパラフィルムでシールして、45℃で1時間穏やかに振盪する。
☆ ここで組織が完全に変性する。
- 3000rpmで10分間遠心し、上清をメスピペットで新しい50mlコーニングチューブに移す。
- 上清に 5M NaCl 950μl を加えて、混ぜる（NaCl の終濃度が0.5M となるように）。その後、18-21ゲージのシリンジで3回剪断する。
- そこに、Oligo(dT) Cellulose のタブレットを入れて、2分くらいふくらして、その後ゆっくりと揺り動かして、分散させる。
- コーニングチューブのふたの周りをパラフィルムでシールして、室温で1時間穏やかに振盪する。
ここで、Oligo(dT) Cellulose の Oligo(dT)鎖 と poly(A)鎖 がハイブリダイズすることによって、poly(A)+mRNAのみが吸着する。
- 室温、3000rpmで10分間遠心し、上清をメスピペットで吸い取って捨て、Oligo(dT) Cellulose の沈殿を Binding buffer 20ml で懸濁させる。
- 室温、3000rpmで10分間遠心し、上清をメスピペットで吸い取って、Oligo(dT) Cellulose の沈殿を Binding buffer 10ml で懸濁させる。
- 室温、3000rpmで10分間遠心し、上清をメスピペットで吸い取って、Oligo(dT) Cellulose の沈殿を Low Salt Wash Buffer 10ml で懸濁させる。この操作をさらにもう2回、遠心後のbufferに濁りが無くなるまで繰り返す。
- Oligo(dT) Cellulose の沈殿を Low Salt Wash Buffer 300μl で懸濁させる。
- Spin Column をエッペンドルフチューブにはめて、そこへメスピペットで Oligo(dT) Cellulose の懸濁液を注ぎ込み、7500rpmで10秒間遠心する。エッペンドルフチューブに滴下した液は捨てる。
- 再び、Spin Column をエッペンドルフチューブにはめて、そこに Low Salt Wash Buffer を満たして、7500rpmで10秒間遠心する。滴下した液は捨てて、この操作をさらにもう4回繰り返す。
- Spin Column を新しいエッペンドルフチューブ（kit付属のもの）にはめて、そこにElution Buffer 200μl を注いでチップで cellulose と Elution Buffer を混ぜ、7500rpmで10秒間遠心する。さらに、もう１度 Elution Buffer 200μl を注いで同じ操作を繰り返す。
- 合わせて400μlの溶出液が得られるはずである。もし、溶出液が400μl以下だった場合、7500rpmで1分間遠心する。
- 2M NaOAc 60μl、100% EtOH 1000μl を加え、upside downして、-80℃で1晩放置する。
- 4℃、15000rpmで20分間遠心し、上清をピペットマンで注意深く除く。
- エッペンドルフチューブの口をパラフィルムでシールして、3か所穴を開け、5分間真空遠心機にかけて、RNAのペレットを乾燥させる。すぐに使わないときは、-20℃で保存する。
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