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●●●●●　in situ (protein)　●●●●●

　　はじめに

　近年の分子生物学の発展に伴って、生物の形態や生物が示す現象が遺伝子レベルで説明されるようになってきている。生物が示す全ての形質は、遺伝子の発現によって制御されていると言ってもよく、その点から考えても分子生物学の流れが、遺伝子の機能の解明や遺伝子の発現調節機構の解明、さらには遺伝子発現のカスケードの解明といった方向に向かっているのは必然といえる。
　我々が、ある遺伝子に着目しその遺伝子の発現と特徴を調べる上で行う実験はほぼ決まっている。cDNAライブラリーをスクリーニングしcDNAを得た後に塩基配列を決定する。その後にcDNAをプローブとしてゲノミックライブラリーをスクリーニングして全長の遺伝子を単離し、全塩基配列を決定する。cDNAをプローブにして、ゲノミックサザン分析を行いコピー数を確認し、ノーザンブロット分析によって発現器官や発現時期を確認する。遺伝子の産物であるタンパク質の発現時期や存在器官を確認するためにはcDNAからタンパク質を合成し、それに対する抗体を作成してウェスタンブロット分析を行う。そして、更に遺伝子の発現を組織レベルでミクロに追跡しようとする場合に用いるのが、in situ ハイブリダイゼーションである。
　cDNAプローブやRNAプローブを合成して組織に対してハイブリダイズし遺伝子の発現を調べる実験が "in situ hybridization analysis"であり、抗体をプローブに用いてタンパク質の存在組織を調べる実験は"in situ localization analysis"と表現せざるを得ないだろうが、この章ではまとめてin situ ハイブリダイゼーションとさせて頂く。
　In situハイブリダイゼーションが行われ始めた頃、cDNAプローブやRNAプローブはアイソトープラベルして用いられていたが、最近はプローブをビオチンやジゴキシゲニンでラベルするNon-RIのシステムが確立されている。光学顕微鏡レベルで観察しようとするときはここに示すNon-RIのin situハイブリダイゼーションで十分である。
　以下、Non-RIで行うin situハイブリダイゼーションの実験について述べてゆくが、まず、RNAを検出する"in situ hybridization analysis"を、続いてタンパク質を検出する"in situ localization analysis"について述べることにする。なお、in situハイブリダイゼーションは、組織の固定と包埋、組織切片の作成、プローブの調製、ハイブリダイゼーション、シグナルの検出の各ステップからなるので順次説明してゆく。

　　in situ localization analysis
　RNA検出のin situ hybridization analysisとは違い、抗体を用いてタンパク質を検出するため、RNaseのコンタミネーションに注意する必要はない。また、試薬類も敢えてDEPC処理を行う必要もない。
　気を付けなければならないのは、一次抗体の活性でありこれが低ければ強いシグナルは得られず、また非特異的なシグナルが多く得られる。

  1. サンプルの固定と包埋
    　基本的にはin situ hybridization analysisと同じである。唯一異なる点は、固定液の組成である。

    1. 試薬の調製

      1. 固定液
          2. 3% paraformaldehyde
          50mM NaCl
          50mM Na-Phosphate Buffer (pH7.3)

      2. 脱水・置換のためのエタノール、ブタノール系列
        　in situ (mRNA)の項を参照

    2. 実験操作
      　in situ (mRNA)の項を参照

    3. 注意事項
      　組織の固定液には、glutaraldehydeを加えてはいけない。

  2. 切片の作成と脱パラフィン
    　in situ (mRNA)の項を参照

  3. ハイブリダイゼーション〜洗浄
    　正確には「ハイブリダイゼーション」ではない。一次抗体との反応である。

    1. 試薬の調製

      1. TBST
        　0.1% Tween 20/TBS

      2. ブロッキング液
        　2% Blocking Reagent/TBST

      3. 一次抗体液
        　一次抗体をブロッキング液で100〜200倍に希釈する

    2. 実験操作

      1. 脱パラフィンしたスライドグラスをブロッキング液に2時間、室温で浸す。このとき緩やかに振盪する。
      2. ブロッキング処理後、スライドグラスを取り出し傾けてブロッキング液をほぼ取り除く。
      3. スライドグラス上に一次抗体液を300μl滴下し、カバーグラスをかけチャンバーに入れて一晩、4℃で放置する。
      4. スライドグラスを取り出し、カバーグラスを外してTBSTに浸して室温で10分間3回洗浄する。

    3. 注意事項
      　一次抗体の量については検討すること。なお、ここで用いる一次抗体は、目的のタンパク質に対する抗体である。

  4. シグナルの検出
    　DIG Nucleic Acid Detection Kitを用いる。また、ここで用いる二次抗体は、一次抗体を作成した動物のIgGに対する抗体であり、それにアルカリフォスファターゼが結合したものである（例：anti-mouse IgG Alkaline Phosphatase Conjugated)。

    1. 試薬の調製

      1. ブロッキング液
        　in situ (mRNA)を参照

      2. 二次抗体液
        　二次抗体をブロッキング液で500〜2000倍に希釈する

      3. TBST
        　AP9.5

    1. 実験操作

      1. TBSTで洗浄を行ったスライドグラスを、ブロッキング液に30分〜1時間浸す。このとき緩やかに振盪する。
      2. ブロッキング処理後、スライドグラスを取り出し傾けてブロッキング液をほぼ取り除く。
      3. スライドグラス上に二次抗体液を300μl滴下し、カバーグラスをかけチャンバーに入れて室温で1〜2時間放置する。
      4. スライドグラスを取り出し、カバーグラスを外してTBSTに浸して室温で10分間3回洗浄する。
      5. AP9.5に10分間浸す。これらの洗浄操作は緩やかに振盪しながら行う。
      6. スライドグラスを検出液に移し、発色状態を観察しながら室温でインキュベートする。
      7. 発色反応の停止はTBS又はTBSTでの洗浄によって行い、十分にTBSで洗浄した後、水で十二分に洗浄する。
      8. 水封入し、写真撮影を行う。

    2. 注意事項
      　この方法で得られる青紫色の沈殿はキシレンに若干解けるようであり、封入のための脱水系列の最終段階で緩やかに溶解してしまう。このため、手早く脱水処理しカナダバルサムで封入するか、もしくは水性の封入剤を用いと良いと思われる。

  5. おわりに
    　一連の実験によって、遺伝子がどの組織で発現しているか、タンパク質がどの組織に存在しているかは確認できる。顕微鏡観察を行って確認できる結果であるため、あとは写真撮影がデータの質を決定する。この点は特に気を付けた方がよい（この原稿を書いている時点で、主にこの点が原因で筆者は投稿論文を２回リジェクトされている）。
    　また、切片の切り方には気を付けた方がよい。その点についてこの章では特に述べなかったが、参考図書として挙げた成書を参考にしていただきたい。

  6. 参考図書
    1. 村松正実・岡田博文編　遺伝子工学ハンドブック　実験医学別冊羊土社　1992
    2. 新津恒良・平本幸男編　実験生物学講座　2　光学・電子顕微鏡実験法　丸善株式会社　1983
    3. 野村慎太郎・稲澤譲治著　脱アイソトープ実験プロトコール　1　DIGハイブリダイゼー
    4. ション　細胞工学　別冊9　秀潤社　1994

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