- 一本鎖cDNA合成
- ウォーターバス42℃にセット
- 別のウォーターバス72℃にセット
- 試薬類はon ice。SuperScriptII（以下SSII)だけは-20℃
- mRNAを氷上でとかす
- 氷上で、1.5ml チューブに以下の試薬類を混合して、反応液を作る（チューブにサンプルmRNAの名前/識別番号を記入しておく）
| mRNA 1mg/ml |
2μl（contains 2μg） |
| Anchored oligo-(dT)25 |
2μl |
| Rondom Nonamer |
2μl（＊） |
| Distilled water |
18μl（＊） |
※ Nonamerの添加はoligo dT以外にinternalからも逆転写を開始させ、ラベリング効率を上げるため。
- 70℃で5分間プレアニール
- 室温25度で10分インキュベート
- そのチューブに以下の試薬類を加える
| 5×SSII reaction buffer |
8μl |
| 0.1M DTT |
4μl |
| dNTP mix |
2μl |
undiluted Cy3-dCTP
(或いはundiluted Cy5-dCTP) |
2μl |
- 緩やかに撹拌しスピンダウン
- -20℃からSSIIを氷上へ
- 2μlのSSIIを加え緩やかにピペッティングしスピンダウン
- 42℃暗所で1-2.5時間。
※注：プローブ調製には、スライド１枚当たり１μgのmRNAが必要。従って、このプロトコールでは、スライド２枚分のプローブが調製できる。
- RNAの除去
- 42℃から取り出して、94℃で3分間インキュベートこの際アルミ箔で上部を覆い遮光する
- 2.5MNaOHを4μl加える
- 37℃15分
- 2MMOPS or 2MHEPES 20μlを加え緩やかにピペッティングし、スピンダウン
- cDNA probe purification
- GFXカラム（AP社）or QIAquick PCR purification Kit (Qiagen社)
- 精製後、バキュームコンセントレーター（Speedvac等）で乾燥させる。
（この際アルミ箔で上部を覆い遮光する）
- プローブは調製後、直ちにハイブリダイゼーションを行う方が望ましい。
（すぐに使用しない場合、精製プローブは-20℃暗所で短期間保存可能。）
- 乾燥させたラベル済みのプローブを滅菌蒸留水で溶かす。
（上記のラベリングプロトコールの場合、１２μlの水を加え、２本のチューブに６μlずつ、とする。）
（以下、チューブ１本分のハイブリダイゼーションのプロトコールを記す。）
- ミラータイプのスライドガラス板（type ７）を使ってマイクロアレー（以下、単にスライドグラスと称する）を作った場合には、ハイブリダイゼーション前に、前処理しておく。（前処理することにより、Cy3, Cy5の発色能の違いが少なくなる）。
- スライドグラスの前処理
- 55℃で予熱済みの５ＸSSC, 0.2%SDSを用いて、スライドグラスを55℃で２時間インキュベート（２時間を超過しないこと。）
- 前処理後、手早く滅菌蒸留水中でリンスし（５回上下させる）、引き続き、手早くイソプロパノール中でリンスした後（２回上下させる）、直ちに圧縮空気（エアーダスター等）で乾かす。
- ハイブリダイゼーション
- ６μlの水に溶かしたプローブを95℃で4分間インキュベートする。（熱変性）この際、アルミ箔で上部を覆い遮光する。
- 氷上で３０秒、急冷する。
- プローブに 1.5μlの oligo A80 ( 1mg/ml)を加え混合する。（最終濃度：50ng/μl） （ターゲットDNAのpolyAT構造にnonspecificにmRNAのpolyA が結合するのを抑制するため）
- 70℃で45分間インキュベートする。この際、アルミ箔で上部を覆い遮光する。
- 7.5μlの４Ｘ マイクロアレイハイブリダイゼーション溶液 ver. 2 (Cat.No.RPK0325)と、15μlの脱イオンホルムアミドを加え、なるべく泡を立てないようにピペッテイングして混合する。
（Sigma, Merck等の脱イオンホルムアミドを使用。未開封凍結保存ならば和光も可）
- スライドガラスとカバーグラス上のチリ・ホコリを、圧縮空気（エアーダスター等）で除去する。
- プローブ（最終容量 30μl）をスライドグラスの上に、下記のどちらかの方法でapplyする。
- プローブを、スライドグラスの「利き手と反対側の短辺」の近くにのせ、柄付き針か、細いチップを用いて、徐々にカバーグラスをかぶせてゆく。
- スライドグラス上に先ずカバーグラスを置き、その間にプローブを流し込む。キャピラリーアクションにより、プローブは自然に広がる。
- スライドグラスを４２℃暗黒下で一昼夜、加湿状態でハイブリダイズさせる。
- ハイブリ後の洗浄
- 予め、第１洗浄液（１ＸSSC, 0.2%SDS）と第２洗浄液（0.１ＸSSC, 0.2%SDS）を55℃に暖めておく。
（第１・第２洗浄液については、以下、55℃で予熱したものを使用する。）
- スライドグラスをインキュベータから出し、未使用の第１洗浄液中に沈めながら、ブレード等でカバーグラスを取り除く。（直ちに、3.の新しい洗浄液に入れる）
- 第１洗浄液で、暗黒下１０分間穏やかに振とうしながら洗浄する。
（洗浄操作は室温で行っても良い。）
- 第２洗浄液で、暗黒下１０分間穏やかに振とうしながら洗浄する。
（洗浄操作は室温で行っても良い。）
- 4.と同じ操作を行う。
- 0.１ＸSSCで、室温、暗黒下１分間穏やかに振とうしながら洗浄する。
- 6.と同じ操作を行う。
- 滅菌蒸留水で手早くリンスし（５回上下させる）、直ちに圧縮空気（エアーダスター等）で乾かす。
- 次に、スキャナーで、シグナルを検出する。