Top > 実験プロトコール > オリジナル > 遺伝子発現など > DIG-Label DNA プローブの作成
●●●●●　DIG-Label DNA プローブの作成　●●●●●

　Roche（かつてのBoehringer Mannheim）のDIG DNA Labeling and Detection Kitを使用する。PCRによるラベルは別項で述べる。

  1. キットの付属品

    Hexanucleotide mixture Vial Number 5
    dNTP mixture (dUTP-DIG contained) Vial Number 6
    Klenow fragment Vial Number 7

  2. 準備するもの

    　ピペットマン、チップ、エッペン、滅菌水、
    　高速冷却遠心器、ガスコンロ、恒温槽、ボルテックスミキサーなどの一般実験器具
    　グリコーゲン (Boheringer Mannheim, Molecular biology grade)、
    　4M LiCl、100%エタノール、0.2M EDTA (pH 8.0)
    　TE または TE/ 0.1% SDS(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.1% SDS)、

  3. 実験操作

    1. ラベルするためのテンプレートDNA溶液をエッペンドルフチューブに調製する
      100ng〜3000ng / 10μlとするが、この時最大で15μlまで使用できる
      なお、テンプレートDNAは滅菌水で溶解するのが望ましい
    2. テンプレートDNAを100℃で10分間処理する
      テンプレートの２本鎖DNAを１本鎖に変性する
      この時、ブロックインキュベーターを用いても構わない
    3. 変性処理したテンプレート溶液を氷上で10分間急冷する
      これで１本鎖が維持される
    4. 一旦遠心し（Flash）壁面に付いた水滴を落とす
    5. 滅菌水を加え、テンプレートDNA溶液を15μlとする
    6. 2μlのhexanucleotide mixtureを加える
    7. 2μlのdNTP mixtureを加える
    8. 1μlのklenow fragmentを加える
    9. ピペッティングにより混和し、遠心（Flash）する。泡立てると酵素が失活する
    10. 37℃のエアインキュベーター（恒温槽）で一晩反応させる
    11. 2μlの0.2M EDTAを添加・混和し、反応を停止する
      なお、この段階でグリコーゲンを加えても構わない
    12. 2.5μlの4M LiClを添加し、混和する
    13. 75μlのEtOHを加え、よく混和した後に、-30℃で2時間以上放置する
    14. 15000rpm、4℃、15分の遠心をした後に上清を捨てる。
    15. 沈殿を70%EtOHでリンスし、再度遠心する（5分程度）
    16. 上清を捨て、沈殿を乾燥した後に、50μlのTEで沈殿を溶解する。この時点で加温（37℃）しても構わない
    17. 使用時まで-30℃で保存する
Top > 実験プロトコール > オリジナル > 遺伝子発現など > DIG-Label DNA プローブの作成