Wizard法

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●●●●●　Wizard法 (Promega)　●●●●●

　ここでは、Wizard mini-prep(Promega)の使用法について概説する。これを用いて単離したプラスミドDNAは、ベクターDNA調整、プローブ調整、塩基配列の決定などといった数多くの面で利用可能である。ただし、一度に単離できるプラスミド量は、多くて10μg程度である。さらに多量に必要な場合には、別のキットを用いるようにする。

キットの付属物

Cell suspension solution
Resin
Column wash solution	使用前に、100%エタノールを等量加える
Column
Cell lysis solution	キットに付属しているが、その都度調整した方がよい
Neutralization solution

準備する物

ピッペトマン
チップ
エッペン
100ml三角フラスコ
抗生物質	Amp, Kmなどで、保存液は終濃度の1000倍に作製しておく。大抵の場合、50mg/mlで作製し、フィルター滅菌する
白金耳
ガスバーナー
クリーンベンチ
恒温振盪機
恒温槽
高速微量遠心器
ボルテックスミキサー
5ml注射器

試薬類
1. 2x LB培地
  
  2% Bacto Trypton
  
  1% Bacto Yeast extracts
  
  1% NaCl
2. 1x TE
  
  10mM Tris-HCl(pH8.0)
  
  1mM EDTA
3. 5N NaOH
実験操作
1. E.coliの培養
  1. 5mlの2×LBを滅菌した100mlの三角フラスコに入れ、抗生物質を加える。
  2. 大腸菌の生えたプレートからシングルコロニーを白金耳でとり、37℃で一晩培養する。
2. Mini-prep kitを用いたプラスミドの単離
  1. 翌朝、実験を始める前に、次のものを準備する。
    　キットの内容物を室温に戻す。0.2N NaOH/1% SDSを調製する。
    　1xTEを65℃に保温する。
  2. 1.5mlのエッペンに培養液を1.5ml注ぎ、4℃･4000rpmで5分間、2回遠心する。
  3. 上清を完全に除き、Cell Suspension solutionを200μl加え、ボルテックスで完全に懸濁する。
  4. O.2N NaOH/1% SDSを200μl加え、透明になるまで丁寧に混合する。
  5. Neutralization solutionを200μl加える。激しく混合し、完全に中和する。
  6. 4℃･12000rpmで5分間遠心する。
  7. 上清を別のエッペンに移し、再度4℃･12000rpmで5分間遠心する。
  8. 上清を別の2mlのエッペンに移す。
  9. Resinを撹拌してから、エッペンに1ml加える。
  10. 3ml注射器からシリンダーを抜き、columnを装着する。
  11. 9.の溶液をデカントで注射器に入れ、下に100ml三角フラスコを置いて、シリンダーを押し下げる。
  12. columnを外し、シリンダーを抜き、再度columnをつける。
  13. Culumm wash solutionを2ml注射器に入れ、シリンダーを押し下げる。
  14. columnを外し、1.5mlのエッペンにのせる。
  15. 4℃･12000rpmで20秒間遠心する。
  16. columnを別のエッペンに移し、65℃の1xTEを50μl columnに注ぐ。
  17. 1分間室温に放置する。
  18. 4℃･12000rpmで20秒間遠心する。
  19. 一部をとって、分光光度計でDNAを推定する。定量法に関しては、別項(核酸の定量)を参照のこと。
  20. 4℃あるいは-20℃に保存する。

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2%	Bacto Trypton
1%	Bacto Yeast extracts
1%	NaCl

10mM	Tris-HCl(pH8.0)
1mM	EDTA