KOAc法

それぞれのE.coliが抵抗性を持つ抗生物質を加えた2.8mlの2×LB培地（A.tumefaciensを培養する場合にはYEP培地あるいはYEB培地）に、シングルコロニーから取ってきた菌を植え、37℃で16時間（A.tumefaciensの場合は28℃で24時間）培養する。

プラスミドを単離する当日にはあらかじめTEGを冷却し、0.2N NaOH-1%SDSを調整しておく。

1.5mlチューブに培養液を移し4℃、4000rpmで10分間遠心する。

上清をデカンテーションによって捨てた後、残りの培養液をすべて1.5mlチューブに移し 3.と同様の遠心を行う。

ピペットマンによって上清をきれいに除いた後、100μlの氷冷したTEGを加えてボルテックスを用いて懸濁する。

5分間、室温で放置する。

200μlの0.2N NaOH-1％SDSを加え、正確に5分間氷中に放置する。

150μlの氷冷した3M KOAcを加え、5分間氷中に放置する。
　 ※3M KOAcは、KOAc 147.2gを精製水に溶かし、500mlにfill upして調製する。

4℃、15000rpmで10分間遠心し、上清をデカンテーションにより別の1.5mlチューブに移す。

フェノール・クロロホルム（1:1）を400μl加え、激しく撹拌する。

室温、12000rpmで2分間遠心する。

上清をピペットマンによって別の1.5mlチューブに移し、1mlの100％エタノールを加え、-80℃で10分以上（あるいは-20℃で2時間以上）放置する。

4℃、15000rpmで5分間遠心する。

70％エタノールを500μl加え、4℃、15000rpmで5分間遠心する。

上清をデカンテーションによって捨て、(14)の操作をもう一度繰り返す。

上清を除いた後に4℃、15000rpmで1分間遠心する（フラッシュ）。

遠心式濃縮機によって沈殿を乾燥させた後に、TEを10μlに溶かす。