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●●●●●　ボイリング法　●●●●●


  1. 試薬の調製

    1. STET
      8% Sucrose
      5% Triton X-100
      50mM EDTA (pH8.0)
      50mM Tris-HCl (pH8.0)

    2. TE
      10mM Tris-HCl (pH8.0)
      1mM EDTA (pH8.0)

    3. リゾチーム溶液
      　10mg/ml リゾチーム in TE

  2. 前日の実験操作

    1. 試験管などに、3mlの、適当な抗生物質を加えたLB培地を分注する
    2. トランスフォームを行って得られたシングルコロニーを滅菌した爪楊枝で拾い上げる
    3. 試験管内の培地に植菌する
      　この前にマスタープレートを作っておくことを勧める
    4. 37℃で一晩振盪培養する

  3. 当日の操作

    1. 培養物各1.5mlをエッペンドルフチューブに分注する
    2. 5000回転で5分間室温で遠心して大腸菌を集め、上清をほぼ完全に除去する
      　全てのサンプルに対して菌体回収をまず行う
      　この時点で沸騰したお湯（または100℃のブロックヒーター）を作っておく
      　引き続いて行うリゾチーム処理・煮沸の操作は、一度に８本まで
    3. エッペンドルフチューブ内の菌体ペレットを400μlのSTETに懸濁する
      　このときの懸濁はピペッティングによって行い懸濁後は氷中に沈める
    4. 菌体懸濁液にリゾチーム溶液を40μlずつ加える
    5. ボルテックスミキサーで十分に撹拌する
    6. 撹拌後は氷上においた煮沸用のチューブラックに載せてゆく
    7. ８本全てにリゾチーム溶液を加えた後に1分間煮沸し、直後氷冷する
      　この懸濁から煮沸・急冷までの操作を１サイクルとしてサンプル全てについて行う
    8. 煮沸・急冷の終わったサンプルについて15000回転、4℃で15分間遠心する
      　遠心後、チューブの下部に大腸菌のゲノム・細胞壁等からなる「たん」ができる
    9. たんを滅菌爪楊枝で除く
    10. 上清に等量のイソプロパノールを加えよく混ぜる
    11. 室温で10分以上放置する
    12. 15000回転、室温で15分間遠心する
    13. 上清をほぼ完全に取り除く
    14. 1mlの70%エタノールでリンスする
    15. 15000回転、室温で5分間遠心する
    16. エタノールをほぼ完全に除く
    17. 沈殿を50〜100μlのTEに溶かす
      　なお、増殖能の低いものであった場合20μlのTEに溶かす
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