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●●●●●　アルカリ-SDS法　●●●●●

  1. 試薬

    1. Lysozyme Solution (100ml)
      Glucose 0.9g
      0.5M EDTA (pH8.0) 2.0ml
      1M Tris-HCl (pH 8.0) 2.5ml

    2. Lysozyme Solution w/ Lysozyme
      　10mg/ml Lysozyme in Lysozyme Solution

    3. Alkaline Solution
      0.2N NaOH
      1.0% SDS

    4. PCI（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール）
      TE飽和フェノール 25
      クロロホルム 24
      イソアミルアルコール 1

    5. TE
      10mM Tris-HCl (pH 8.0)
      1mM EDTA (pH 8.0)


  2. 実験方法

    1. 50ml LB-Ampを用いてクローンを培養する（34℃〜37℃、一晩）
    2. 培養物を50mlのコーニングチューブに移す
    3. 3000〜5000rpmで5〜10分間遠心する
    4. 上清をデカンテーションで捨てる
    5. 3000〜5000rpmで1〜2分間遠心する
    6. 上清をピペットマンで取り除き、氷中に立てる
    7. 沈殿を2mlのLysozyme Solutionに懸濁する
    8. 7.に2mlのLysozyme Solution w/ Lysozymeを加え、穏やかに撹拌する
    9. 氷中で5分間放置
    10. 8mlのAlkaline Solutionを加え、穏やかに撹拌する
    11. 氷中で5分間放置
    12. 8mlの3M NaOAc (pH5.2)を加え、穏やかに転倒混和する
    13. 氷中で5分間放置
    14. 10000rpmで15分間、0〜4℃で遠心する
    15. 上清20mlを新しいコーニングチューブに移す
    16. 20mlのPCIを加え、激しく撹拌する
    17. 37℃で10〜20分間振盪する
    18. 激しく撹拌した後に、5000rpmで5〜10分間、室温で遠心する
    19. 上清20ml（程度）を新しいコーニングチューブに移す
    20. 等量のIsopropanolを加え、混和する
    21. 室温で10〜30分（もしくはそれ以上）放置する
    22. 10000rpmで15分、室温で遠心する
    23. 清をデカンテーションで捨てる
    24. 10000rpmで1〜2分、室温で遠心する
    25. 上清をピペットマンで取り除く
    26. 沈殿を400ulのTEに溶解する
    27. 溶液をエッペンドルフチューブに移す
    28. 10ulの10mg/ml RNase (DNase free)を加える
    29. 37℃で30分インキュベートする
    30. 100ulの5M NaClを加え、混和する
    31. 200ulの30% PEGを加え、混和する
    32. -80℃で15分（凍るまで）冷却する
    33. 室温に放置し、溶解後すぐに、15000rpmで15分、0〜4℃で遠心する
    34. 上清をピペットマンで取り除く
    35. 15000rpmで0.5〜1分、0〜4℃で遠心する
    36. 上清をピペットマンで取り除く
    37. 沈殿を300ulのTEで溶解する
    38. 33ulの3M NaOAc (pH 5.2)を加え、混和する
    39. 999ulのEtOHを加え、混和する
    40. -80℃（または-30℃）で30分、冷却する
    41. 15000rpmで15分、0〜4℃で遠心する
    42. 上清をピペットマンで取り除く
    43. 70% EtOHでリンスする
    44. 15000rpmで5分、0〜4℃で遠心する
    45. 上清をピペットマンで取り除く
    46. 沈殿を50〜100ulのTEに溶解する

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