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●●●●●　高分子量DNAの単離　●●●●●
  1. 若葉からの高分子量核DNAの調製

    1. 約20g(or 10g)の葉を5cm程度に刻む。
    2. 液体窒素で10分間予冷しておいた直径15cmの乳鉢に入れる。
    3. 乳鉢ですりつぶす。
    4. 5分で完全に粉末になるので、それ以上はすりつぶさない。
    5. 乳鉢を室温で10分間放置する。
    6. すりつぶした葉っぱを予冷しておいたnuclei isolation buffer 50mlの入ったビーカーに入れる。
    7. プラスチック性のスパチュラで手早く懸濁する。
    8. シャーベット状になり、室温で15分放置する。
    9. さらに、nuclei isolation bufferを100ml加え、よく懸濁する。
    10. 0.1M EDTAに浸してオートクレーブした１重のミラクロスで濾過する。
    11. 濾液を50mlコーニングチューブに分注する。
    12. 600xg 4℃で10分間遠心する。
    13. デカントで上清を除く。
    14. nuclei isolation buffer 10mlに再懸濁し、1本の50mlコーニングチューブにまとめる。
    15. 600xg 4℃で10分間遠心する。
    16. 平行して、1.5% low-melting point agaroseを溶かして、45℃に保存する。
    17. チューブを逆さまにして、上清を完全に除く。
    18. 沈殿に全量で1.2mlになるように、nuclei isolaiton bufferを加える。
    19. 先切りチップでよく懸濁する。
    20. 19.で得られた懸濁液を40℃で1-2分加温する。
    21. 等量のagaroseと混ぜる。
    22. gel plugの型を蒸留水でよく洗い、拭いた後組み立てる。
    23. 21.で得られた試料を注入する。
    24. ラップで包み氷上で30分おいて固める。
    25. 50mlコーニングチューブにlysis buffer 30mlを取る。
    26. ミクロスパチュラでgel plugをチューブに移す。
    27. 50℃のincubatorで静置して、48時間消化する。
    28. 24時間で一度lysis bufferを交換する。
    29. lysis bufferを除き、gel plugをTE50 buffer 30mlで5回洗う。
    30. TE50 buffer 30mlに0.1M PMSF 600ulを加えて、50℃2時間静置し、proteinase Kを失活させる。
    31. TE50 buffer 30mlで5回洗う。

      • ここまでの問題点
        1. 0.1M PMSFの作成法
          　0.1Mになるように100%エタノールに溶かして-20℃保存
          　2mlのエッペンに作れば充分量ある
        2. low melting point agarose
          　FMC InCert TM Agarose　または　SeaPlaque GTG
        3. 注入された試料の数
          　BioRadのCHEF付属のgel moldを使うと1plug当たり250ul(20x9x1.5mm)が10plug
        4. pro-K処理あとの保存法
          　Pro-K処理はまとめて、10個全部行い、余分の試料はTE50で洗浄後、そのままTE50 bufferで4℃で保存する。長期保存の場合は、EDTAの濃度を100mMにする。

  2. 高分子量DNAの部分消化と分画・濃縮

    1. TE50 bufferを除き、TE buffer 50mlを加え、4℃で2時間放置する。
    2. 1時間で一度TE bufferを交換する。
    3. plugの重量を換算して得た体積ではなく、体積そのままを体積(250ul)とする。
    4. gelの体積の5倍量(1.25ml)の1.2x MboI reaction bufferを加える。
    5. さらに、反応系全体(1.5ml)に対して、0, 0.1, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0U/mlの濃度でMboIを加える。
    6. 4℃でover night incubateする。
    7. PFGE用の1% agarose gelを0.5x TBEで作製する。
    8. 予備実験ではSeaKem GTGを用いて1枚につき、100ml作製する。
    9. 本実験ではSeaPlaque GTG agaroseを用いて、220ml作製する。
    10. 隙間ふさぎ用に、1% low melting point agarose gelを0.5x TBEで調整する。
    11. 1M MgCl2を終濃度10mMになるように加え、軽く混ぜ、氷上に1時間、37℃に10分間放置する。
    12. 直ちに反応系の10倍量の0.5MEDTAを加えて、反応を停止させる。
    13. 隙間ふさぎ用gelを溶かして45℃におく。
    14. gel plugを0.5x TBEで洗い、agarose gelのwellに挿入する。
    15. ピペットでwel内の余分なbufferを除き、隙間を先のgelで埋める。
    16. 分子量markerとして、rambda ladder PFG markerを使う。
    17. PFGEをおこなう。泳動のパラメーターは次のようにする。
    18. Initial time 20秒, Final time 20秒, 電圧170V, 泳動時間15時間, 温度14℃で泳動を行う。
    19. 泳動後、予備実験の場合は、gel全体をEtBr染色し、ゲノムDNAの消化の程度を確認する。
    20. 最適濃度を決定し、本実験をスケールアップして同様に行う。
    21. 本実験では、markerと隣のレーンを3mm程度切りだし、染色する。
    22. これを頼りに70-95kbの部分を切り出す。
    23. 切り出したgelを2mm角に刻む。
    24. agarose I bufferで1度洗い、bufferを交換してgelを平衡化する。
    25. スライスしたgelに付着している余分のbufferを取り去る。
    26. 70℃のwater bathに15分置き、gelを溶かす。
    27. gelが溶けきってない場合は、10分間延長して完全にgelを溶かす。
    28. 40℃のwater bathに移して、緩やかに混ぜる。
    29. gel 1gあたり10unitの beta-agarase Iを加えて、緩やかに混ぜ、40℃のwater bathにいれる。
    30. 30分後にもう一度緩やかに混ぜ、さらに2時間incubateしてgelを消化させる。
    31. 氷上に10分間置き、上清を2.2ml遠心チューブに移す。
    32. 14,000xg 5分間遠心する。
    33. 45℃にしたheat blockにサランラップを敷き、32.で得た上清を載せる。
    34. gel 1g当たり10unitsのbeta-agarase Iを加え、溶解したgelを消化する。
    35. 水分が蒸発して全体の液量が1/5になるまで濃縮する。
    36. シャーレに50mlのSTE bufferをいれ、セルロースフィルターVSWP02500を浮かべる。
    37. 静かにピペットで、濃縮したDNA溶液を載せ、1時間静置し、透析し消化したアガロースを除く。
    38. フィルターにgelが残っている場合にはDNA溶液を遠心してgelの小粒を除く。
    39. フィルターからDNA溶液を回収し、33.～38.のプロセスをさらに2回繰り返す。
    40. 液をheat blockに戻すときにフィルターに残ったDNAを少量のSTE bufferで洗い取る。
    41. ただし、2度目以降はbeta-agarase I消化はしない。
    42. DNA濃度が最初の50倍の100ug/mlになるまで繰り返して、濃縮と透析を繰り返す。

  3. 器具・薬品など
      • ミラクロス: CALBIOCHEM社(#475855)
      • プラスチック製のスパチュラ
      • spermine: 和光純薬生化学用:250mg
      • spermidine (d=0.92g/ml): 和光純薬生化学用:1g
      • 2-mercaptoethanol: 和光純薬生化学用
      • low-melting point agarose(FMC InCert TM Agarose): FMC BioProducts
      • proteinase K:和光純薬(160-14001)生化学用:100mg/5ml DDW ---> 20mg/ml
      • Lambda ladder PFG marker: New England Biolabs(第一化学)　#340-185328:\12,700
      • beta-agarase I: New England Biolabs(第一化学):100unit/\12,800　タカラ:100unit/\15,000
      • VSWP02500: Millipore
      • CHEF-DR II: BIO-RAD

  4. 必要なbuffer
    1. nuclei isolation buffer stock
      　 Stock 　 　
      10mM Tris-HCl (pH9.5) 1M 5ml 　
      20mM EDTA (pH 8.0) 0.5M 20ml 　
      80mM KCl 1M 40ml (1M 37.275g/500ml)
      0.5M sucrose 　 85.575g 　
      4mM spermidine 1M 2ml (1M: 1g/6.885ml)
      1mM spermine 1M 500ul (1M: 250mg/1.236ml)
      0.1% 2-mercaptoethanol 100% 500ul 　
      　 　 500ml 　

    2. 1.5% low-melting point agarose
      　 Stock 　
      10mM Tris-HCl (pH 9.5) 1M 50ul
      10mM EDTA (pH 8.0) 0.5M 100ul
      1.5% agarose 　 75mg
      　 　 5ml

    3. lysis buffer
      　 Stock 　
      1% Sarkosyl 　 10ml
      0.2M EDTA 0.5M 40ml
      0.1mg/ml Proteinase K 20mg/ml 500ul
      　 　 100ml

    4. TE50 buffer
      　 Stock 　
      10mM Tris-HCl (pH 8.0) 1M 5ml
      50mM EDTA (pH 8.0) 0.5M 50ml
      　 　 500ml

    5. 1.2x MboI reaction buffer
      　 Stock 　
      12mM Tris-HCl (pH 8.0) 1M 120ul
      180mM KCl 1M 1.8ml
      8.4mM 2-mercaptoethanol 1M 84ul
      12ug/ml BSA 1mg/ml 120ul
      　 　 10ml

    6. TBE buffer
      　 5x 0.5x
      Tris 54g 45mM
      EDTA-2Na 4.15g 1mM
      Borate 27.5g 　
      　 1000ml 　

    7. beta-agarase I buffer
      　 Stock 　
      10mM Tris-HCl (pH 7.5) 1M 1ml
      5mM EDTA 0.5M 1ml
      0.1M NaCl 5M 20ml
      　 　 100ml

    8. STE buffer
      　 Stock 　
      10mM Tris-HCl (pH 8.0) 1M 1ml
      1mM EDTA 0.5M 200ul
      0.1M NaCl 5M 20ml
      　 　 100ml

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