サザンハイブリダイゼーションを行ったり、ゲノムライブラリーを作製するためには全DNAの単離を行わなければならない。ここで言う全DNAとはゲノムDNAと細胞質オルガネラDNAの両者を併せたものを言う。現実的には、ゲノムDNAのみを単離するのは非常に困難であることから、全DNAを単離する事によって、先に述べたような実験を行う。全DNAを単離する方法にはいくつか知られているが、現在最も一般的に用いられているCTAB(Cetyl trimethyl ammonium bromide)法について概説する。
　植物には動物と異なって、細胞壁があるために動物細胞のように高分子DNAを容易に単離する事が困難であるとされている。こうしたことから、ここで説明する方法では、植物組織を液体窒素存在下で粉砕したものから、DNAを単離するものである。高分子DNAとして単離するためには、激しいピペット操作は厳禁であり、その場合にはチップの先端を切断して広くしておくと良い。また、用いる試薬、器具(チップ、エッペン、はさみ)類は、当然のことながらゲノムDNA専用にすることを薦める。プラスミドDNAがコンタミ(contamination)した場合に、問題となることがあるので、十分に注意されたい。

1. 準備
   
   1. 1×CTAB溶液
      　2×CTAB溶液を2倍希釈
      
      
   2. 2×CTAB溶液
      

      2%	CTAB
      100mM	Tris-HCl(pH 8.0)
      1.4M	NaCl
      20mM	EDTA

      
      
   3. CTAB沈殿buffer
      

      1%	CTAB
      50mM	Tris-HCl(pH 8.0)
      10mM	EDTA

      
      
   4. 1xTE
      

      10mM	Tris-HCl(pH 8.0)
      1mM	EDTA

      
      
   5. NaCl-TE
      

      1M	NaCl
      10mM	Tris-HCl(pH8.0)
      1mM	EDTA

      
      
   6. 10% CTAB溶液
      

      10%	CTAB
      0.7M	NaCl

      
      
   7. クロロホルム・イソアミルアルコール(24:1)
      
   8. RNase(10mg/ml; DNase freeであること
      
   9. イソプロパノール
      
   10. 100%エタノール
       
   • 恒温槽、振盪機、液体窒素、乳鉢、乳棒
     
   • 15ml, 50ml遠心チューブ、エッペン、先切りチップ、ピッペトマン
     
   • パスツールピペット、低速遠心器、薬匙
     ここで調製したCTAB関連溶液は、１ヶ月以内に使いきるようにし、使いきらなかった場合には新しく調製する方がよい。
     
     
2. 実験操作
   
   1. 実験を始める前に、恒温槽を70℃にセットし、2×CTAB溶液・1×CTAB溶液・10%CTAB溶液をインキュベートしておく。
      
   2. 3gの若い葉を切り刻み乳鉢に入れ、液体窒素を加え、途中試料が溶けないように数回液体窒素を加える。このときサンプルとして用いる葉は、なる べく早朝に集めた方がよい。葉の粉砕は、DNAの抽出効率に大きく影響を 与えるので、充分粉砕すること。
      
   3. 2×CTAB溶液が6ml入った50mlチューブに粉砕した試料を液体窒素で冷却しておいた薬匙を用いて加える。さらに1×CTAB溶液を3ml加え、固まりがなくなるまで70℃で混合する。
      
   4. 3.のチューブを55℃で40分間40rpmで往復振とうする。
      
   5. 4.のチューブにクロロホルム・イソアミルアルコール(24:1)を1vol.加え、室温で20分間おだやかに振盪する。
      
   6. 室温で2800rpm, 20分間遠心し、上層を別の50mlチューブに移す。
      
   7. 6.の下層に1×CTABを6ml加え、室温で10分間おだやかに振とうする。
      
   8. 室温で2800rpm,20分間遠心し、その上層を(6)の上層と一緒にする。
      
   9. 8.のチューブに10%CTAB溶液を0.1vol.加え、70℃で1分間放置し混合する。
      
   10. 9.のチューブにクロロホルム・イソアミルアルコール(24:1)を1vol.加え、室温で10分間おだやかに振とうする。
       
   11. 室温で2800rpm, 30分間遠心する。この上層を別の50mlチューブに移す。
       
   12. 上層に濁りがなくなるまで、(10)から(11)を繰り返す。
       
   13. 12.のチューブにCTAB沈殿bufferを静かに1vol.重層し、静かに混合する。この操作によって、CTAB-DNA複合体が糸状に析出してくる。
       
   14. さらに、CTAB沈殿bufferを5ml重層し、静かに混合する。
       
   15. CTAB-DNAの糸をNaCl-TEを2ml加えた15mlチューブに先を曲げたパスツールピペットで移し、55℃で溶解する。
       
   16. 残った上清を室温で5000rpm,5分間遠心し、上清を捨て、上清を完全に取り除く。
       
   17. 沈殿にNaCl-TEを1ml加え、55℃で溶解する。
       
   18. 15.と17.の溶液を一緒にした後、イソプロパノールを1vol.重層し、混合する。この操作によって、DNAが糸状に析出してくる。
       
   19. デカントで上清を除く。
       
   20. 70%エタノール 5mlを加え、DNAとチューブの内壁を洗い、デカントで捨てる。
       
   21. 100%エタノール 5mlを加え、DNAとチューブの内壁を洗い、デカントで捨てる。残ったエタノールをピペットマンで慎重に吸い取る。
       
   22. 風乾した後、1×TEを500μl加えてDNAを溶解する。
       
   23. RNase(10mg/ml)を3μl加えて37℃で30分間処理し、4℃で保存する。
       
   24. 単離できたDNA量を推定するためには、適当量をアガロース電気泳動し、分子量マーカーの蛍光度と視覚的に比較すればよい。電気泳動については、 別項(アガロース電気泳動法)を参考にしていただきたい。