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●●●●●　cDNA Library　●●●●●

　　はじめに

　植物組織から抽出した poly(A)＋RNA からcDNAライブラリーを作成するには、まず 、poly(A)＋RNAを鋳型として2本鎖DNAを合成し、制限酵素アダプターを付加し、ベクターへ挿入することによって完成する。しかし、cDNA合成に用いたmRNAには、目的とする遺伝子以外のmRNAも含んでいるので、スクリーニングによって目的の遺伝子のcDNAを選抜する必要がある。
　ここでは、cDNAライブラリーの作製方法とスクリーニングの方法について説明する。cDNAライブラリーの作製には、クローニングの効率が良く、スクリーニングか容易であるという特徴を持つλファージがベクターとして一般的に用いられている。一方、プラスミドベクターはDNAの調製が容易であるという点では、λファージベクターよりも優れているが、スクリーニング高率がλファジーベクターに比べてよくないことから、現在ではλファージベクターの方がクローニングの主流として用いられている。ただし、λファージベクターにクローニングした cDNAクローンの塩基配列を決定したりする場合には、プラスミドベクターにサブクローニングする必要があり、プラスミドベクターも重要である。
　cDNAライブラリーを作成する際に合成したcDNAをクローニングするファージベクターとしては、λgt10やλgt11などが主に用いられてきた。近年、λファージベクターにクローニングしたcDNAを簡便にプラスミド(ファージミド)ベクターに変換できるように改良されたベクターが数多く市販されるようになった。そこで、ここではλZAPIIを用い、プラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングを行った後、ヘルパーファージを感染させることによってインサートcDNAの断片をpBluescript SK-にサブクローニングすることができる実験系について説明する。


  1. cDNAの合成、制限酵素アダプターの付加
    　ここでは、cDNA Synthesis kit (Amersham-Pharmacia)を使用する。

    1. キット付属の試薬
      First-strand reaction mixes (5) DTT溶液 EcoRI/NotI adaptors
      Second-strand reaction mixes (5) Klenow fragment T4 DNA ligase
      T4 polynucleotide kinsase ATP溶液 RNase-free water
      spun column (10)

    2. 準備する物

      1. STE buffer
        10mM Tris-HCl (pH7.5)
        1mM EDTA
        150mM NaCl

      2. Ligation buffer
        66mM Tris-HCl(pH 7.6)
        1mM Spermidine
        1mM MgCl２
        15mM DTT
        0.02% BSA

      3. phenol/chloroform/isoamylalcohol
        phenol 25
        chloroform 24
        isoamyl alcohol 1

      4. ヒートブロック、15ml プラスチック遠心管、ボルテックスミキサー

    3. 実験方法

      1. 単離したmRNAをRNase-Free Water20μlに溶かす。 このとき、この溶液中に1-5μgのmRNAを含んでいなければならない。量の 測定に関しては、別項（核酸の定量）を参照のこと
      2. ヒートブロックを用いて65℃で10分間加熱した後、氷水で急冷して5分間放置する。
      3. First-Strand Reaction Mixをフラッシュしてエッペンドルフチューブの 底に集め、DTT Solution 1μlと熱変性したmRNA 1μlを加えて静かに撹拌した後、37℃で1時間保温する。
      4. Second-Strand Reaction Mixをフラッシュし、そこへ(3)の反応液全量加 えて静かに撹拌する。これを12℃で1時間、22℃で１時間保温する。
      5. この間に洗浄bufferとしてligation bufferを用いて、Spun Columnの調製 を行う。Spun Columnの調製方法は次の通りである。

        1. Spun Columnを数回 upside downし、gel を懸濁する。
        2. Spun Columnを15mlコーニングチューブに立てて、gelがある程度落ちつ いたら、上のキャップを外し、次いで下のキャップを外して、gelが沈殿している上面まで水を抜く。このとき、gelを乾燥させないように注 意する。
        3. bufferが落ちたら、下のキャップをつけ、洗浄buffer 2ml を注ぎ、 Spun Columnを数回upside downし、gelを懸濁する。
        4. (5-2)〜(5-3)の操作をさらにもう4回繰り返す。つまり、洗浄buffer は 合わせて10ml使う。
        5. gelがある程度落ちついたら、上下のキャップを外し、Spun Columnから 余分なbufferを抜く。このとき(5-3)のときよりも若干多めにbufferを 残しておく。
        6. 上下のキャップをはずし、Spun Columnを15ml遠心チューブにはめて、1600rpmで2分間遠心する。このとき遠心には、スウィングローターを用 いること。
        7. gelはコンパクトになり、乾燥して、ひび割れている場合もあるが問題 はない。この Spun Column を用いて試料の精製を行う。

      6. 4.のチューブにKlenow Fragment 1μlを加え、37℃で30分間反応させ、 その後65℃で10分間加熱する。
      7. 室温で Phenol/Chloroform/isoamyl alcohol 100μlを加え、軽くボルテ ックスした後、室温、12000rpmで3分間遠心する。
      8. 水層（上層）を、準備しておいたSpun Columnのgelの上面の中央に注ぐ。
      9. Spun Columnを新しい15ml遠心チューブに移して、1600rpmで2分間遠心す る。この操作によって、遠心チューブの底に精製されたcDNA溶液が得られ る。この溶液を新しいエッペンドルフチューブに移す。
      10. 溶出液(cDNA溶液)全量にEcoRI/NotI adaptor 5μl, ATP solution 1μl, T４ DNA ligase 3μl加える。静かに撹拌した後、フラッシュして、12℃で 1晩反応させる。
      11. 反応液を65℃で10分間加熱した後、氷上に置いて冷却する。
      12. ここで、洗浄bufferとしてSTE bufferを用いて、Spun Columnの調製を行 う。Spun Columnの調製方法は前述してある通りに行う。ここで、buffer としてSTE bufferを用いるのはこのcDNAをファージベクターに挿入する場 合である。プラスミドベクターに挿入する場合は、ligation bufferを用 いる。
      13. 11.の反応液にATP solution 10μl, T４ polynucleotide kinase 1μl加 えて、37℃で30分間反応させ、その後65℃で10分間加熱する。
      14. Phenol/Chloroform/isoamyl alcohol 100μlを加え、ボルテックスした後、 室温、12000rpmで3分間遠心する。
      15. 水層（上層）を、準備しておいたSpun Columnのgelの上面の中央に注ぐ。
      16. Spun Columnを新しい15ml遠心チューブにはめて、1600rpmで2分間遠心す る。ここで遠心チューブの底に、制限酵素アダプターが付加したcDNAが得 られる。液料としては、100μlぐらいある。この溶液をエッペンに移す。 この溶液を次の項目の"λZAPIIベクターへの挿入" に用いる。

  2. λZAPIIベクターへの挿入

    　ここでは、cDNA Synthesis Kit (Pharmacia), λZAPII Cloning Kit (STRATA GENE)を用いる。

    1. キット付属の試薬

      λZAPIIベクター(EcoRI digested, alkaline phosphatase treated)
      T4 ligase
      ATP solution

    2. 準備する物

      3M NaOAc(pH 7.0)
      DEPC処理水
      100%エタノール
      グリコーゲン(Boehringer Mannheim, Molecular Biology Grade)

    3. 実験方法

      1. 溶出液(cDNA溶液)20μlに、DEPC処理水11μl,λZAPIIベクター(1μg/μl) 1μl,グリコーゲンを加えて静かに撹拌する。さらに、3M NaOAc 3μl、100% EtOH 60μlを加え、静かに撹拌した後、-80℃で15分間放置する。こ の操作によって、cDNAとベクターを共沈させる。
      2. 4℃、15000rpmで20分間遠心して、上清を除く。この段階で、白い沈澱物 が確認できる。
      3. 80% EtOH 200μlを注いでリンスした後、4℃、15000rpmで5分間遠心して、 上清を注意深く除く。
      4. エッペンドルフチューブの口を開け、サランラップで覆い、室温で10-20 分間放置して乾燥させる。
      5. DNAのペレットをligation buffer 9μlに溶かす。
      6. 先の溶液に、1/10希釈ATP solution(ligation bufferで希釈する)1μl、 T４ ligase 1μlを加えて、静かに撹拌した後、フラッシュして12℃で16時 間反応させる。反応時間を長くした方がライゲーション効率はよい。

  3. ファージへのパッケージング

    　ここではキットして、GIGAPACK III Gold (STRATAGENE)を用いる。

    1. キットの付属品
      red tube
      yellow tube

    2. 準備する物

      1. SM buffer
        100mM NaCl
        8mM MgSO4
        ？？？ Tris-HCl(pH7.5)
        0.01% gelatin

      2. chloroform

    3. 実験方法

      1. yellow tube を氷に立てて、解凍させる。
      2. yellow tube が解凍したら、red tubeを指に挟んで解凍し、ligated cDNA 4μlをred tubeに加える。
      3. yellow tubeから15μlをとり、red tubeに加え、気泡を入れないようによく混合して、フラッシュし、22℃で2時間反応させる。
      4. SM buffer 500μlを加えて希釈し、Chloroform 20μlを加えてよく混ぜる。 これをcDNAを含んだファージ液とする。
      5. 8000rpmで5分間遠心する。

  4. タイターの測定およびマスタープレートの作成
    　形成されたファージが、どの程度のプラーク形成能を有しているかの測定を 行い、それに基づいてスクリーニングすべきファージをまいたプレートを用意する。

    1. 準備する物

      1xLB、20% maltose (濾過滅菌)、1M MgSO4、SM buffer、
      Bottom agar plate (1.5% agar/1xLB:φ90mmのプラスチックシャーレに20mlずつ分注する)、
      Top agar(0.7% agarose (TaKaRa LO3), 1mM MgSO４ /1xLB)、遠心チューブ、滅菌試験管、
      φ90mm滅菌シャーレ、大腸菌(XL1-Blue)、墨汁、3ml注射器、26G注射針、キムタオル、ろ紙、ピンセット、

    2. 実験方法

      1. 大腸菌XL1-BlueをBottom agar plate上に、白金耳を用いて広げる。
      2. 37℃で培養し、単一コロニーを得る。
      3. 単一コロニーを白金耳で培地(1xLB;3ml, 20% Maltose;60μl, 1M MgSO４; 30μl)に加えて、37℃で16時間激しく振盪培養する。
      4. ファージ液をSM bufferで3段階に希釈（1/1, 1/10, 1/100）し、オートクレ ーブした試験管で各ファージ希釈液5μlとXL1-Blue培養液100μlを混ぜて、 37℃で20分間保温してファージを大腸菌に感染させる。
      5. 50℃に保温しておいたTop agar 3mlを試験管に注ぎ、軽く混ぜた後、37℃ に保温しておいたプレートのBottom agar上に撒いて、均一に広げる。
      6. プレートを逆さにして、37℃で12〜14時間保温する(プラークの直径が 0.5mm程度になったところで、恒温器から出す)。
      7. 生えたプラークを数えてタイター(pfu/μl; pfu=plaque formation unit) を計測し、1枚のプレートにつき30,000程度のプラークが形成されるよう に、ファージ液の量を調節して(3)〜(6)と同様の操作によりプラークを形 成させる。これをマスタープレートとする。スクリーニングすべきプラーク数は、目的の遺伝子の発現量によって異なるが、通常1万から100万程度である。

  5. レプリカの作成
    　レプリカとは、プレート上に形成されたプラークをナイロンメンブランに写 し取ったものを意味する。この操作によって、ナイロンメンブラン上にプラー クのDNAが固定化され、次に行うスクリーニングの操作に用いることができる。

    1. 準備する物

      1. メンブラン
        ナイロンメンブレン (Schleicher&Schuell, NY13N Membrane filter 0.45μl, φ82mm)、

      2. アルカリ変性溶液
        1.5M NaCl　　　
        0.5M NaOH

      3. 中和溶液
        1M Tris-HCl(pH7.5)
        1.5M NaCl

      4. 20×SSPE
        0.2M NaHPO４(pH7.4)　　　
        3M NaCl
        20mM EDTA

      5. ピンセット、ろ紙、キムタオル、恒温器



    2. 実験方法

      1. レプリカをとるときTop agarがはがれないようにするために、プラークの形成されたプレートを4℃で2時間以上冷却する。
      2. バットに濾紙を敷き、そこへアルカリ変性溶液を注ぎ、濾紙が完全に濡れ、 表面に溶液が少し浮いている状態にする。中和溶液、2xSSPE(20xSSPEを 10倍に希釈)もアルカリ変性溶液と同様に準備する。
      3. ナイロンメンブレン(Schleicher&Schuell, NY13N Membrane filter 0.45 μl,φ82mm)の光沢のない面をTop agarに密着させる。
      4. その状態で1分間放置し、その間に墨汁をすった注射器で3ヶ所マークして、 プレートとメンブレンの対応する位置関係が分かるようにする。
      5. メンブレンをTop agarからはがした後ひっくり返して、Top agarに密着し た面を上に向けた状態で、準備しておいたアルカリ変性溶液の上において 正確に5分間放置する。
      6. 接着面を上にしたままメンブレンを中和溶液に移して、5分間放置する。
      7. 接着面を上にしたままメンブレンを2×SSPEに移して、5分間放置する。
      8. メンブレンをキムタオルの上に置き、乾燥させる。
      9. メンブレンをキムタオルで挟み、80℃で2時間Bakeして、DNAをメンブレン に共有結合させる。
      10. すぐに使わない場合は、キムタオルに挟んだまま袋に入れ、乾燥した状態 で保存する。

  6. ハイブリダイゼーション・洗い・検出

    　 得られたメンブランと目的のプローブとをハイブリダイゼーションさせ、非特異的に結合したプローブを除き、結合しているプローブのみを検出すること によって、目的とするクローンが得られる。この操作は、プラークハイブリダ イゼーションに特別なものではなく、コロニーハイブリダイゼーションやサザ ンハイブリダイゼーションにおいても用いられる方法である。
    　 そこで、ここではプラークハイブリダイゼーションを例にとって説明を行う。 ハイブリダイゼーションに用いる溶液の組成は、含んでいるプローブを除いて ほとんどの場合、共通であることが多い。しかしながら、洗いの条件は、検出 しようとするものと、用いるプローブの相同性が重要であり、高い相同性を示 す場合には、0.2xSSC, 0.1% SDSで行うのが適当である。それに対して、相同性 が低い場合には、SSCの濃度が、0.5xから1xぐらいで行うのが適当であると思わ れる。ここでは、プローブとしてdig標識のものを用い、検出法として、蛍光基 質(CSPD)を用いるため、放射性同位体を用いたときのように、X線フィルム上に 感光する前にどの程度のプローブが残っているかをモニターすることができな い。そのため、適切な洗いの条件を決定するまでに、数回の試行錯誤を必要と するかもしれない。なお、dig標識のプローブの調整に関しては、別項(プローブの調製)を参照していただきたい。

    1. 準備する物

      1. TBS buffer
        50mM Tris-HCl(pH8.0)
        0.9% NaCl
        0.02% NaN3

      2. Hybridization buffer
        5× SSC
        1% Blocking reagent
        0.1% Sarcocyl
        0.02% SDS

      3. AP 9.5 buffer
        0.1M Tris-HCl(pH9.5)
        0.1M NaCl
        5mM MgCl2

      4. Blocking buffer
        　1% Blocking reagent/TBS buffer

      5. 5M NaCl
      6. 1M MgCl2、
      7. 2×SSC, 0.1% SDS
      8. 0.2×SSC, 0.1% SDS
      9. Anti-digoxgenin-AP Fab fragment (Boehringer Mannheim)、
      10. CSPD (Disodium 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tri-cyco[3.3.1.1３,７]decan}-4-yl)phenyl phosphate; TROPIX)、

    2. 実験器具
      ハイブリバック、恒温振盪機、遠心チューブ、バット、ビニール袋、ポリシーラー、振盪機、X線フィルム、現像液(レンドール)、3%酢酸、定着液（レンフィックス）、 オートラジオグラフィー用カセット、

    3. 実験方法

      1. メンブレンをハイブリバックに入れ、溶液を入れるところを除いて3方をシールする。プレハイブリダイゼーションでは1度に20枚程度処理しても 大丈夫である。
      2. Hybridization buffer 20〜40ml（メンブレンが充分浸る程度）を注ぎ、 泡を追い出した後、シールする。
      3. 65℃で8時間、ゆっくり（およそ30rpm）振盪して、プレハイブリダイゼー ションを行う。
      4. プローブを沸騰したお湯で10分間温めた後、氷水で急冷してそのまま10分間放置する。このことにより、プローブが変性され、1本鎖の状態になる。
      5. プレハイブリダイゼーションの終わったメンブレンを、新しいハイブリバ ックに入れ、3方をシールする。ハイブリダイゼーションではメンブラン を10枚以上重ねないようにする。10枚以上のメンブランを行いたい場合に は、2つ以上に分けて並べる。
      6. プローブ 20mlを注ぎ、泡を追い出した後、シールする。
      7. 65℃で16時間ゆっくり振盪して、ハイブリダイゼーションを行う。このとき、振盪器の中に0.2x SSC, 0.1% SDSも一緒に入れて、65℃に温めておく。
      8. ハイブリダイゼーションが終わったら、プローブは遠心チューブに回収し、 パラフィルムでシールして、-20℃で保存する。このプローブは繰り返し 使うことが出来る。
      9. ハイブリダイゼーションの終わったメンブレンをバットに入れ、2×SSC, 0.1% SDS 250mlを注いで、室温で5分間振盪する。これを2回繰り返す。
      10. 溶液を捨て、65℃に温めておいた0.2×SSC, 0.1% SDS 250mlを注いで、 65℃で20分間振盪する。これを2回繰り返す。
      11. 溶液を捨て、TBS buffer 100mlを注いで、1分間洗浄する。
      12. メンブレンをビニール袋に入れ、3方をシールする。
        このときも、10枚以上の場合は、2つに分けて上下に並べる。
      13. Blocking buffer 20mlを注ぎ、泡を追い出した後、シールして、室温で 30分間ゆっくり振盪する。
      14. 溶液を捨て、メンブレンを新しいビニール袋に入れ、3方をシールする。
      15. Anti-digoxgenin-AP Fab fragmentをBlocking bufferで1/5000に希釈した ものを20ml注ぎ、泡を追い出した後、シールして、室温で30分間ゆっくり 振盪する。
      16. メンブレンをバットに入れ、TBS buffer 200mlを注いで、15分間洗浄する。 これを2回繰り返す。
      17. 溶液を捨て、AP 9.5 buffer 200mlを注いで、3分間浸したまま放置する。
      18. メンブレンを新しいビニール袋に入れ、3方をシールする。
      19. CSPDをAP 9.5 bufferで1/500に希釈した溶液10mlを注ぎ、泡を追い出した 後、シールして、暗黒下で5分間反応させる。このときは、10枚以上の場 合は2回に分けて行う。
      20. 袋から出し、キムタオルの上で余分な水分をとる。完全には乾かさず、多 少湿り気を含む程度にする。
      21. メンブレンをサランラップで挟み、X線フィルムの大きさに切ったろ紙に 固定する。
      22. 37℃で15分間放置する。
      23. 暗室の中で、オートラジオグラフィー用カセットに入れ、X線フィルムを 重ねて15分間露光する。露光時間は現像したfilmの像の濃さから、調節する。
      24. X線フィルム用の現像液で数分間現像し、停止液で30秒間停止した後、定 着液に5分間放置する。その後、しばらく水洗した後、X線フィルムを乾燥 させる。

  7. 陽性プラークの打ち抜き
    　前項で検出されたX-ray film上のシグナルを元に、プレートからファージを単離して、シングルプラークを形成させ、そこから陽性のプラークを選択する ことによって陽性のクローンが得られる。

    1. 準備する物
      イルミネーター（ライトボックス）、ピッペトマン、チップ、エッペン、SM buffer、chloroform、ボルテックスミキサー、メス

    2. 実験方法

      1. イルミネーターの上にX-ray filmを置き、その上に墨汁でつけておいたplateのマークとplateをを重ねる。
      2. 1000μl用のピペットマンのチップの先を、火であぶったメスで切り取る。
      3. あらかじめ、打ち抜くプラークの数だけ、エッペンドルフチューブを準備 し、SM buffer 500μlを入れて、chloroform 1滴ずつ落としておく。
      4. 陽性プラークのある位置の周りを、先を切ったチップを付けたピペットマ ンでアガロースごとゆっくりと吸い込んみ、準備しておいたエッペンドル フチューブに入れて、室温で2時間放置する。
      5. エッペンドルフチューブをボルテックスして、ファージを懸濁する。
      6. 以上が1次スクリーニングである。2次スクリーニングでは、ファージ懸濁 液を適当な濃度で撒いて、プレート全体にプラークが100〜200個程度のプ ラークが形成され、シングルプラークが拾えるような状態にする。あらか じめ、いくつかのクローンで10-4〜10-6程度の希釈シリーズを作ってプレ ートに撒き、おおよその見当を付けると良い。
      7. 100〜200個程度のプラークを形成させたプレートが出来たら、5、6を繰り 返してスクリーニングを行う。ただし、7のプラークの打ち抜きでは、ピペットマンではなくパスツールピペットを用いて、シングルプラークにな った単クローンのみを打ち抜くようにする。

  8. in vivo excision

    　λZAP IIベクターの場合、単クローンになったファージ懸濁液にhelper phage(ExAssist)を感染させると、ファージ粒子中に一本鎖のpBluescript SK-を含むphagemidを形成させることができる。これをホストの大腸菌(SOLR)に 感染させ、LB plate (+Amp.)に撒くことによって大腸菌内にphagemidを含んだ コロニーが形成させることによって、容易にプラスミドへのサブクローニング を行うことができる。このため、λDNAを単離して、インサートDNAを単離して プラスミドベクターにクローニングする手間が省ける。ここでは、λZAPII Cloning Kit (STRATAGENE)を用いた実験系について説明を行う。

    1. 試薬類

      1. 1xLB
        1% Bacto-Tyrptone
        0.5% Bacto-Yeast extracts
        0.5% NaCl

      2. 2xYT
        1.6% Bacto-Typtone
        1% Bacto-Yeast extract
        0.5% NaCl(pH7.5)

      3. LB plate (+Amp)
        1% Bacto-Tyrptone
        0.5% Bacto-Yeast extracts
        0.5% NaCl
        1.5% Bacto-Agar
        ※　オートクレーブして、50℃程度に冷却したところで、Ampicilinを終濃度で50μg/mlになるように加える

      4. 20% Maltose

      5. 1M MgSO4

    2. 器具類
      分光光度計、恒温振盪機、ピペットマン、チップ、大腸菌(XL1-Blue, SOLR)、50ml遠心チューブ、恒温槽、ろくろ、スプレッダー(パスツールピペットの細い部分を三角形に曲げたもの)

    3. 実験方法

      1. 大腸菌XL1-Blueを培地(1xLB;3ml, 20% Maltose;60μl, 1M MgSO４;30μl)を用いて、37℃で12時間激しく振盪して培養する。
      2. 分光光度計でXL1-Blue培養液のOD600を測定して、OD600=1.0になるよう1xLBを用いて調製する。
      3. 50ml遠心チューブに(XL1-Blue培養液(OD600=1.0); 200μl, ファージ懸濁液; 100μl, ExAssist helper phage; 1μl)を混ぜる。
      4. 37℃で15分間保温する。
      5. 2×YT 3mlを加え、37℃で2.5時間激しく振盪する。
      6. 70℃で20分間熱した後、4℃、5800rpmで15分間遠心し、上清の一部をエッペンに移す。これをPhage stockとし、4℃で保存する。
      7. 大腸菌SOLRを1×LB 3mlで、37℃で12時間激しく振盪して培養する。
      8. 分光光度計でXL1-Blue培養液のOD600を測定して、OD600=1.0になるように1xLBで調製する。
      9. Phage stockを2×YTで10倍から10,000倍程度に希釈する。
      10. SOLR培養液 200μlに対して、希釈したPhage懸濁液1μlずつ混合する。
      11. 37℃で15分間保温する。この操作によってphageが大腸菌に感染する。
      12. 感染させた液から50μl取ってLB plate (+Amp)に撒き、ろくろとスプレ ッダーを用いて均一に広げる。
      13. Plateを逆さまにして、37℃で16時間保温する。
      14. ここで単クローンのコロニーが得られ、このコロニーを形成する大腸菌は クローニングしたcDNAをインサートとして持つプラスミドpBlueScript SK-を内部に含んでいる。これを鋳型として、インサートの両末端の塩 基配列を決定するようなことに使える

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