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●●●●●　ノーザン分析　●●●●●

　　はじめに

　遺伝子が組織において発現するときにmRNAへと転写が行われ、続く翻訳過程を経てタンパク質へと合成される。ある遺伝子がある特異的組織において何らかの機能を果たす場合、その転写産物の量は遺伝子、組織（器官）によって大きく異なることが考えられる。また、遺伝子発現は転写翻訳時にいろいろなレベルで制御されている。そこで、遺伝子の発現を転写産物(mRNA)の量で見ようというのがこの実験の主たる目的といえよう。例えば、葉、根、茎頂部から単離したmRNAを試料とし、解析したい遺伝子あるいは類似した遺伝子をプローブとして検出されたバンドの濃さからそれら組織による発現の違いを確認できる。また、植物に日長の処理を与え、時間差を（日数）をつけた茎頂部を試料としてノーザン分析を行えば、茎頂部の生育発達を追いながら解析したい遺伝子の発現量の増減を追うことができる。また検出されたバンドの位置からその遺伝子のエキソン部分の長さを推定することもできる。
　実験の操作においてはサザン分析とほぼ同じであるがノーザン分析ではRNAを相手にするだけに、RNaseの混入に気をつけなければならない。そのため、用いる試薬はほとんどDEPC処理を行わなければならず、実験器具もRNA専用のものを用い、さらに操作中は手袋やマスクを身につけなければならない。尚、ここで紹介する方法はnon-RIによって行える方法である。
　ノーザン分析の実験はなにかと気を使うことが多いため、はじめは知っている人に要所要所確認をとり、また、教わりながら挑戦してほしい。

　　実験を行うに当たって

　解析したい試料からあらかじめ必要な量mRNAを単離し用意しておくこと（mRNA単離参照）。また、プローブも用意しておくこと（DNAプローブまたはRNAプローブ；DIGラベルプローブの作製参照）。

  1. 準備

    1. 器具

      50℃ドライバス
      RNA用ピペットマン
      RNA用にオートクレーブしたエッペン　箱に詰めてある新品を専用に使用する
      RNA用にオートクレーブしたチップ　　箱に詰めてある新品を専用に使用する
      使い捨て用手袋 、アルミホイル、サランラップ
      電気泳動槽（RNA専用ミューピット）
      オートクレーブ後乾熱滅菌した200ml容三角フラスコ(X2)
      50ml,15ml容コーニングチューブ、濾紙、ナイロンメンブラン（Nytran(S&S)）
      X線フィルム(Fuji,Kodak)

    2. 試薬
      　基本的には、試薬を調製した後、ドラフト内で0.2%（または0.1%）になるようにDEPC(SIGMA)を加え激しく撹拌し、メジュウムビンのふたをゆるめ30分放置した後、オートクレーブ処理を行う。（手袋をはめること！また、DEPCを加えるのに使ったチップは手袋に包んで捨てること！）

      1. DEPC処理水
        　DEPC (DiEthyl PyroCarbonate)処理後オートクレーブした水
        　（500ml容メジュームビンに5本は必要）

      2. 100mM リン酸Na緩衝液 (Sodium phosphate buffer ;PB)
        1M NaH２PO４ 3.9ml
        1M Na２HPO４ 6.1ml
        （pH 7.0） 100ml
        ※　DEPC処理してからオートクレーブ。

      3. 6M グリオキサール(glyoxal)
        　2ml glyoxalあたり1g AG501-X8(Bio-Rad)を加えて、4℃で2〜4時間放置 する。pHが5.5〜6.0になったことをpH試験紙で確認後、静置して上清をとり、エッペンチューブに分注して、-20℃で保存する。一度開封したものはその度ごとに使い捨てる

      4. glyoxal/DMSO gel-loading buffer
        100% glycerol 500ul
        0.1M Sodium phosphate (pH7.0) 100ul
        bromophenol blue 2.5mg
        xylene cyanol FF 2.5mg
        　 1000ul

      5. 20x SSC
        　DNA用のものに0.2%になるようにDEPC処理を行い、オートクレーブすればよい。

      6. アガロース（FMC社）

      7. 3% H２O２
        　実験中に30% H２O２をDEPC処理水で10倍に希釈し、500ml用意する。

      8. RNA ラダーマーカー（GIBCO BRL社）

      9. SSC/SDS
        　 2x SSC, 0.1% SDS溶液 0.1x SSC, 0.1% SDS溶液
        20x SSC 50ml 2.5ml
        10% SDS 5ml 5.0ml
        　 500ml 500ml
        ※　DEPC処理してオートクレーブする

      10. PBS
        Na２HPO４,12H２O 10.4g
        NaH２PO４,2H２O 1.35g
        NaCl 1.95g
        　 500ml
        ※　DEPC処理してオートクレーブする

      11. MBS(pH7.0)
        maleic acid 5.80g
        NaCl 4.38g
        　 500ml
        ※　DEPC処理してオートクレーブする

      12. ブロッキングバッファー(blocking buffer)
        　PBS あるいは MBS 100mlにblocking reagent 1gを加えて、電子レンジで 溶かした後DEPC処理してオートクレーブする。

      13. 抗体
        　Anti-digoxigenin-AP Fab fragments　(Boehringer Mannheim 社)

      14. プレハイ−ハイブリ溶液(prehybri- and hybri-solution)

        1. cDNAプローブを用いる場合
          20x SSC 25ml
          10% SDS 200ul
          10% sarcosyl 1000ul
          blocking reagent 1g
          　 100ml
          ※　電子レンジで溶かした後DEPC処理してオートクレーブする。

        2. RNAプローブを用いる場合
          20x SSC 25ml
          10% SDS 200ul
          10% sarcosyl 1000ul
          blocking reagent 1g
          ホルムアミド（オートクレーブ後） 50ml
          　 100ml
          RNA-RNAの結合力が強くstrengencyを厳しくするため、ホルムアミドを加える（最終濃度50%）。電子レンジで溶かした後DEPC処理してオートクレーブする

      15. 1M Tris-HCl(pH 9.5)
        　一般試薬の章を参照（pHを9.5に合わせてオートクレーブのみする）
        　（注）DEPC処理をしてはいけない

      16. AP9.5
        5M NaCl 10ml
        1M MgCl2 25ml
        　 450ml
        DEPC処理した後、オートクレーブする。
        使用直前に1M Tris-HCl(pH 9.5)(オートクレーブ済み)を50ml加える。

      17. 基質
        　Lumigen PPD （Boehringer Mannheim 社）あるいは CSPD（Tropix社）
        　CDP-Star（Roche）、AMPPDなど

  2. 実験操作

    1. ゲルを作る

      1. 天秤の上にアルミを敷き、そのうえに薬包紙を敷く。
      2. アガロースを0.7g測りとり、オートクレーブ,乾熱処理した三角フラスコ に移す。
      3. 450mlDEPC処理水に対し100mM リン酸緩衝液(PB)を50mlコーニングで測りとり加え10mM PB溶液を作る。
      4. 2.の三角フラスコに10mM PB 70ml加え（コーニングで測りとる）電子レ ンジでアガロースを溶かし、1%アガロースゲルを作る（長ゲルで1枚分）
      5. 冷めたら型に流し込む。

    2. RNAのグリオキサール処理〜電気泳動〜トランスファー

      1. RNAのグリオキサール処理

        • 試料RNA(1μg)とマーカーRNAを用意
        • ドライバスを50℃に保温しておく
        • それぞれのサンプルにつき以下の容量でRNA用エッペンにとる。

          　 　 Final
          6M （グリオキサール）glyoxal 2.7μl 1M
          0.1M PB溶液 (pH7.0) 1.6μl 10mM
          DMSO 8.0μl 50%
          mRNA(1μg)+DEPC処理水 3.7μl 　
          　 16.0μl 　

          一般にはDMSOを用いるが、mRNAの濃度が低く、緊急避難的時にはDMSOを用いず次の容量で混合する。

          　 　 Final
          6M （グリオキサール）glyoxal 2.7μl 1M
          0.1M PB溶液 (pH7.0) 1.6μl 10mM
          mRNA(1μg)+DEPC処理水 11.7μl 　
          　 16.0μl 　


        • 50℃で１時間保温する。（denature処理）
          　☆　1時間の間に泳動槽の洗浄をする
        • 3% H２O２を500ml用意(450ml DEPC処理水 + 30% H２O２)
        • 終了30分前に泳動槽の中に注ぎ満たし、10分放置
        • 流しに捨てDEPC処理水で3,4度すすぐ
        • 10mM PBで泳動槽内を満たしゲルを入れる
        • 50℃で変性させておいたサンプルを10分間氷冷
        • 氷冷後、4μlのloading bufferを加えて、泳動用試料とする。

      2. 電気泳動

        1. それぞれ試料をアプライし、50Vで電気泳動する
        2. 泳動中に以下のことをやっておく
          ☆　10分おきにdisposableピペットで＋槽のバッファを−槽へ、−槽のバッファーを＋槽へ2,3度バッファー交換する。この操作を行うことで、グリオキサールとRNAの解離を防いでいる。
          ☆　泳動中にトランスファーに用いる濾紙、Nytran(S&S)、キムタ オルを切る。大きさは次の通りである。


      3. トランスファー

        1. 四角型シャーレを用意し、受け皿にゲルを型ごと移す。
        2. マーカーの部分のゲルをサージカルナイフで切る（後でEtBr染色を行う）
        3. 試料を泳動した方のゲルの左上角を少し切る。
        4. ゲルの上下盛り上がった部分も切る。
        5. 泳動槽内のバッファーを流しに捨て、DEPC処理水で泳動槽内を3,4度すす ぐ。
        6. 20X SSCで泳動槽内を2,3度共洗いをする。
        7. 四角型シャーレのふたに20X SSCを入れ、濾紙ブリッジを架ける。
        8. 濾紙の上から20x SSC注ぎ、濾紙と濾紙の間の気泡を除き、さらに、 図2のように＋槽と−槽に下から2/3程度20X SSCを注ぐ。
        9. ゲルを濾紙の上に図2のように表裏逆さにしておく。
        10. 今までゲルを保存していた四角型シャーレをDEPC処理水ですすぎ、DEPC処 理水を満たす。
        11. その中にNytranを浸し、さらに、四角型シャーレに入っている20x SSCに 浸す。
        12. Nytranをゲルの上に重ねる。（光っていない面をゲルと接触させる）
        13. 順に濾紙を重ねる（図2）。
        14. さらにキムタオルを重ね（図2）、その上に適当な重しをして15〜24時間 トランスファーする。ときどきキムタオルを交換する。
        15. マーカーのゲルは次のような処理をしバンドの位置を測定するとよい
        16. マーカーを含むゲルを50mM NaOH溶液に15分浸しアルカリ処理をする。
        17. NaOH溶液をを捨て、DEPC処理水で軽くゲルをすすぎ洗いする。
        18. DEPC処理水を除いた後、0.2M NaOAc(pH 4.8)溶液に15分浸し中和処理を行う。
        19. NaOAc溶液を捨て、DEPC処理水で軽くゲルをすすぎ洗いする。
        20. 5μg/μl エチジウムブロマイド溶液(EtBr)に45分浸す。
        21. 5〜15分DEPC処理水で振盪洗いをする。
        22. ゲルにUV光を当て定規と一緒に写真を撮る。
        23. 写真を撮るのが困難な場合は直接バンドのある位置を測定し、分子量と泳動開始部からの位置の関係を片対数表に直線で表す。

    3. トランスファー終了〜プレハイ〜ハイブリ

      1. トランスファー終了

        1. キムタオルを取り除く
        2. 濾紙、ゲル、Nytran、濾紙、濾紙を一緒に取り出し、ひっくりが えして濾紙が上にくるようにサランラップの上におく。
        3. 濾紙をゆっくりはずし、ゲルの上面を露にする。ゲルを除く前にボールペンなどで（PentelのHybridボールペンなんかがいいらしい）ゲルの 形、ウェルの位置などをゲル越しにNytranに書き込む。
        4. ゲルを除きNytranをキムタオルに包んで2時間80℃でベイキングする。

      2. プレハイブリダイゼーション〜ハイブリダイゼーション

        1. ベイキングが終わったらNytranをハイブリバッグに入れ、ハイブリ溶液を適当量加えた後、気泡を抜いて袋を閉じ（シールする）、65℃で4時間, 30rpm位でプレハイを行う。
          ☆　プレハイが終わる30分前にプローブの調製を行う
        2. DIGラベルしたプローブ液の入ったエッペンを100℃,10分保温
        3. 10分氷中に放置し、フラッシュする
        4. ハイブリ溶液を20mlコーニングにとり、これにプローブ液を加え混合する
        5. プレハイした溶液を捨て、Nytranを新しくハイブリバックに移し、プローブ液を加える。気泡を抜いて袋を閉じ、65℃,30rpm,16〜20時間ハイブリ を行う。
        6. このとき、0.1x SSC,0.1% SDS溶液も65℃で保温しておく。

    4. 洗い〜抗体,基質反応〜露光

      1. 洗い

        1. プローブの液をコーニングに回収しアルミホイルで包んで、-80℃で保存 する。
        2. Nytranをそれぞれ深型シャーレに移し、2x SSC,0.1% SDS溶液を加え5分間 室温で穏やかに振盪洗いをする（2回）
        3. 次に65℃に保温した0.1x SSC,0.1% SDS溶液を加え、20分間65℃で穏やか に振盪洗いをする（2回）
        4. 0.1x SSC,0.1% SDS溶液を捨て、PBSあるいはMBS溶液を加え1分間室温で穏やかに振盪する。
        5. ポリビニール袋にNytranを移し、ブロッキングバッファーを加え、気泡を抜き、適当にシールした後30分間室温で穏やかに振盪する。
          ☆　この間に抗体を用意する。
        6. ブロッキングバッファーに5000倍に希釈する。
        7. ブロッキングバッファーを捨てNytranを新しいポリビニール袋に移す。

      2. 抗体,基質反応

        1. 抗体液を加え気泡を抜き、適当にシールした後、30分間室温で穏やかに振盪反応させる。
        2. Nytranを深型シャーレに移し、PBSまたはMBS溶液を加え、30分間室温で穏やかに振盪させる（2回）
          ☆　2回目の振盪の間にAP9.5と基質を作る。
        3. AP9.5 450mlにオートクレーブ済みの1M Tris-HCl(pH 9.5)を50ml加える。（すでに加えてある場合は省略）
        4. 上で作ったAP9.5に基質が100倍希釈になるように加える。

      3. 露光の準備

        1. 黒下敷きあるいはそれと同じくらいの厚紙に丁寧にサランラップをまく。
        2. PBSあるいはMBSを捨て、代わりにAP9.5を加え3分浸す。
        3. Nytranをポリビニール袋に移し、基質を加え気泡を抜いて、適当にシールし、暗黒下で5分間放置し反応させる。
        4. 袋からNytranを取り出し、下敷き（あるいは厚紙）を包んだサランラップの上に並べ、Nytranが乾かないうちにさらにその上からサランラップをかぶせる。
        5. 37℃のエアーインキュベーターに20分間放置する。
          ☆　この間にNytranの大きさに合わせて、暗室内でフィルムを切り、 もと入っていた箱に入れておく。

      4. 露光

        1. 暗闇の中でカセットケースにNytranを包んだ下敷きを入れ、その上にフィルムを載せカセットを閉じる（はじめは15分露光で試してみて、バンドの濃さによって露光時間を変えてみる）。
        2. 適当な時間になったら赤色光の中でフィルムを現像液（レンドール）の中に 2分ほど入れる。
        3. 赤色光のもとで、3% 酢酸停止液に移し30秒つける。
        4. 赤色光のもと定着液（レンフィクス）に移し、2分以上浸しておく（余分な銀粒子が外れるまで）
        5. 水洗を十分に行い、フィルムを乾かす。
        6. 現像、定着液はもとの瓶に戻し、停止液はその都度使い捨てる。
        7. フィルムにNytranの形、ウェルの位置などを書き込み、その後ハイブリしたプローブをはがすためにデハイブリを行う。
        8. フィルムに検出されたバンドから、分子量の推定などを行う。

    5. デ・ハイブリダイゼーション

      　ここでは2通りの方法を紹介する。

      1. SSC利用

        1. Nytranを深型シャーレに移し、これに電子レンジでチンした0.1x SSC,0.1% SDS溶液をかけ（200ml三角フラスコを用いる）、65℃で5分間穏やかに振盪 させる（3回）
        2. キムタオルにNytranを挟んで乾燥機で乾かし、ビニール袋に閉じて保存する。あるいはリハイブリに用いる。
        3. すべての試薬、器具を丁寧に後かたずけをする。

      2. NaOH利用

        1. 50〜100mMのNaOHに30〜60分間室温振盪する。
        2. 2x SSCで10分間室温振盪する。これを2回繰り返す。
        3. リハイブリの場合はプレハイのステップに戻る。メンブランを保存する場合は、乾燥後、ポリ袋に閉じて保存する。
        4. 後かたずけをする。

  3. あとがき

    　ノーザン分析は遺伝子の発現を転写産物の量で見ようとする実験であることは先に述べた。その量というものは露光した後のフィルムにうつしだされるバンドの濃さ（強弱）となって現れてくる。しかし、人間の皮膚、空中の埃、微生物中にRNaseが多く存在していることから、操作中のRNaseの混入による泳動試料のmRNAの分解という可能性を考えることができる。そこでmRNAの分解の有無を証明するために、どの組織、器官においても一定量で発現している遺伝子をプローブとして確認に用いればよい。そういったプローブの例としてアクチン遺伝子がある。この遺伝子をプローブとして用い、どの泳動試料においても一定の濃さでバンドが検出されるというように、行った実験の是非を証明することができる。実際の操作としては目的のプローブに先に述べた遺伝子をプローブとして混ぜ、ハイブリの操作を行えばよい。
    　さて、ノーザン分析の実験は一つ一つの操作に無意識のうちに神経を使っているものである。そのせいか、マスクを外すと自然と大きな溜息が出てくるものである。こうした実験中の精神的負担を少しでも軽減するため、時間的な流れに沿ってプロトコールを作製してみた。このプロトコールでは、一つ一つの操作や待ち時間の利用なども、かなり詳しく紹介したつもりである。是非一度機会があれば、このプロトコールを参考に実験を行っていただきたい。何か不都合な点、また、改良点があれば、是非筆者までご連絡下されば幸いである。
    　何はともあれ、ノーザン分析によって得られる情報は多いため、決して尻込みせず、頑張って欲しい。

  4. 引用

    1. 木南凌 サザンブロットとノーザンブロット法 新生化学実験講座２ 核酸II 構 造と性質
    2. Thomas,P.S. (1980) Hybridization of denaturated RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. USA 77,5201 -5205.
    3. Sambrook,J., Fritsch,E.F. and Maniatis.T. (1989) Molecular Clonig: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
    4. 野村慎太郎、稲澤譲治　脱アイソトープ実験プロトコール?DIGハイブリダイゼーション　細胞工学別冊9　秀潤社

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